轉染試劑是一種多聚陽離子聚合物,具有較高的陽離子電荷密度使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”(protonsponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞,其效果好于脂質聚酰胺,經進一步的改性后,其轉染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低。
所列步驟適用于24孔板培養的哺乳動物細胞,其他培養材料,請參考表1按照轉染規模調整,所有數量和體積均是按孔計算。大部分細胞系所使用的DNA(μg)與VigeneFection(μg)的比值為1:3或1:4,轉染狀態良好的細胞可獲得高轉染效率、高表達水平和低細胞毒性。
1、貼壁細胞:轉染前一天每孔0.5-2×105個細胞接種于500μl培養基中,在轉染時細胞可長至90-95%融合;懸浮細胞:在配制轉染液前每孔4-8×105個細胞接種于500μl培養基中。
2、轉染液制備,每孔細胞用量如下:
A、用50μlDMEM培養基稀釋質粒DNA,輕輕混勻。
B、取適量VigeneFection在50μlDMEM培養基中稀釋,室溫孵育5min。
C、將前兩步所稀釋的DNA和VigeneFection混合,輕輕混勻,室溫放置30min。
3、在每孔細胞中加入混合后的轉染液,輕輕搖勻。
4、貼壁細胞可在轉染4-6h后可更換培養基,懸浮細胞可在轉染后的18-48h之間,對細胞進行換液。轉染18-48h之后可檢測基因表達。如果檢測到蛋白表達,請在轉染后24-72h收集培養液。
5、對于穩定轉染,在轉染24h后以1:10傳代培養,第二天可加入選擇培養基。
轉染試劑注意事項:
推薦在混合前使用Opti-MEM(Cat.No.267485)或DMEM細胞培養基(Cat.No.SH30022.01B)稀釋VigeneFection和核酸。
轉染過程中勿向培養基中添加抗生素,以免造成細胞死亡。
不同批次實驗請保持細胞接種條件相同。
轉染前細胞的狀態好壞對終的轉染效果高低影響很大,請務必保證轉染前,細胞處于良好的生長狀態。